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摘要：目的通过非靶向代谢组学技术结合生物通路分析（ingenuitypathwayanalysis，IPA）探讨益胃饮干预胃癌前病变的潜在作用机制。方法采用N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）建立胃癌前病变大鼠模型，采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）检测并表征大鼠血清代谢物，筛选模型组和益胃饮组大鼠血清中具有显著变化的代谢物，并通过IPA软件预测其潜在作用靶点与机制。结果益胃饮可有效干预大鼠胃癌前病变进程；胃癌前病变模型大鼠血清中有23个代谢物有显著变化（P＜0.05），益胃饮可显著回调其中13个代谢物趋于正常水平（P＜0.05），主要涉及不饱和脂肪酸的生物合成，缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成，鞘脂代谢，花生四烯酸代谢，类固醇激素合成等代谢途径；益胃饮干预胃癌前病变与抑制体内皮素-1（ET-1）和白介素-8（IL-8）信号途径密切相关。结论益胃饮可通过回调花生四烯酸代谢等代谢途径和抑制ET-1、IL-8信号传导途径改善炎性环境，从而抑制胃癌前病变进程。

胃癌（gastriccancer，GC）是全球范围内发病率和死亡率极高的恶性肿瘤之一[1]。胃癌前病变（gastricprecancerouslesions，GPL）是胃癌炎癌转化的重要阶段，包括慢性浅表性胃炎、萎缩性胃炎、肠上皮化生、异型增生、胃早癌等不同阶段[2]。GPL具有双向转化的特点，早期干预和治疗可有效逆转胃癌的发生发展，现已成为胃癌二级预防的重点研究领域[3-4]。

益胃饮是浙江省名中医柴可群教授治疗胃癌前病变、胃癌的临床经验方，此方取健脾益气、袪瘀化痰、清热解毒3法，具有扶正气、调胃气、抗邪毒的功效。课题组前期研究表明益胃饮可诱导人胃癌细胞凋亡，并显著抑制其增殖、迁移与侵袭[5-6]；也可显著抑制小鼠转植性前胃癌术后复发和肺转移瘤的形成[7]。经多年基础研究与临床实践证实，益胃饮可有效防治胃癌，但具体作用机制尚不明确。

代谢组学是系统生物学的一个重要分支，是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后发展起来的新兴“组学”，其整体、宏观的指导思想与中药整体性作用一致，适用于中药及复方整体性评价和复杂干预体系研究[8-9]。本研究通过构建N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）诱导的胃癌前病变大鼠模型，并采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（UPLC-Q/TOF-MS）开展血清非靶向代谢组学研究，寻找益胃饮防治胃癌前病变的关键代谢物，并通过生物通路分析（ingenuitypathwayanalysis，IPA）结合ELISA法验证，揭示益胃饮干预胃癌前病变的潜在作用靶点和机制，为益胃饮防治胃癌前病变的临床应用提供科学依据。

1材料与仪器

1.1药材

黄芪（内蒙古）、浙麦冬（浙江）、三叶青（浙江）、姜半夏（浙江）、蒲公英（山东）、麸白芍（浙江）、藤梨根（浙江）、薏苡仁（浙江）和香茶菜（浙江）购自杭州华东中药饮片有限公司，批号分别为、、、、、、、、，经浙江省中医药研究院高家鉴主任中药师鉴定，分别为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsia的干燥根、百合科植物麦冬Ophiopogonjaponicus(L.f)Ker-Gawl.的干燥块根、葡萄科植物三叶崖爬藤TetrastigmahemsleyanumDielsetGilg的干燥块根、天南星科植物半夏Pinelliaternate(Thunb.)Breit.的干燥块茎、菊科植物蒲公英TaraxacummongolicumHand.-Mazz.的干燥全草、毛茛科植物芍药PaeonialactifloraPall.的干燥根、猕猴桃科植物中华猕猴桃ActinidiachinensisPlanch.的干燥根、禾本科植物薏苡Coixlacryma-jobiL.var.ma-yuen(Roman.)Stapf的干燥成熟种仁、唇形科植物香茶菜Rabdosiaamethystoides(Benth.)Hara的干燥根茎。

1.2仪器

SCIEXX-R四级杆飞行时间质谱仪、ExionLCAD高效液相色谱仪（美国ABSCIEX公司）；20R低温高速离心机（美国Beckman公司）；IKA微型涡旋混合仪（德国艾卡公司）；AUWD电子天平（日本岛津公司）；CentriVap低温真空离心浓缩仪（美国Labconco公司）。

1.3药品与试剂

MNNG（批号75F71-TF）购自上海蓝季生物公司；色谱级甲醇、色谱级乙腈购自美国Merck公司；质谱级甲酸购自美国Fisher公司；超纯水购自屈臣氏集团有限公司；内皮素-1（ET-1）试剂盒（GJZ）、白介素-8（IL-8）试剂盒（批号GPW）购自上海朗顿生物技术有限公司；脱氧胆酸（32-ADE-24-1）、甘氨鹅去氧胆酸钠盐（1--JJM-3）、牛黄石胆酸钠盐（1-WGS-26-1）、胆酸（1--GXS-4）、甘氨脱氧胆酸钠盐（05-SSG--67）对照品（质量分数均大于98%）购自上海谱芬生物科技有限公司；亮氨酸（-）、苯丙氨酸（-）对照品（质量分数均大于95%）购自中国食品药品检定研究院。

1.4动物

SPF级Wistar雄性大鼠30只，10～12周龄，体质量约g，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号为SCXK（浙）-。

2方法

2.1益胃饮提取液制备

取黄芪g、浙麦冬g、三叶青g、姜半夏g、蒲公英g、麸白芍g、藤梨根g、薏苡仁g、香茶菜g，置于煎药机中加入10倍体积的纯水浸泡30min，加热（℃）提取2次，每次提取1h，合并滤液浓缩，制得药材质量浓度为1.09g/mL的益胃饮提取液。

2.2益胃饮成分表征

2.2.1益胃饮提取物供试品溶液制备取1.0mL益胃饮提取液，置mL量瓶中，加入去离子水超声30min，至浓缩液完全溶解，加入去离子水定容，以r/min离心20min，取上清液即为益胃饮提取物供试品溶液。

2.2.2色谱条件WatersAcquityUPLCHSST3色谱柱（mm×2.1mm，1.8μm），流动相A为0.1%甲酸乙腈，流动相B为0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱：0～2min，1%A；2～5min，1%～20%A；5～13min，20%～45%A；13～17min，45%～99%A；17～20min，99%A；体积流量为0.3mL/min；柱温为40℃；进样室温度为8℃；进样体积为3μL。

2.2.3质谱条件雾化气和干燥气压力为.kPa（55psi），气帘气压力为.kPa（35psi），离子源温度为℃，喷雾电压为?4V（负离子模式）；高分辨一级扫描范围为m/z50～1，子离子扫描范围为m/z25～0，一级质谱扫描累积时间为0.15s，二级质谱扫描累积时间为0.05s；二级质谱采用IDA模式获得，去簇电压为?60V，碰撞能为（?35±15）eV。

2.2.4数据分析原始数据采用SCIEXOS软件采集和处理。SCIEXOS软件包含多重置信标准，包括质量准确度、保留时间、同位素、化合物库的匹配使用。本研究根据化合物的一级精确质量数、同位素分布比和MS/MS搜索SCIEXOS配置的中药二级数据库TCMMS/MSLibrary（包含0多种中药化合物二级数据），即可在在无标准品的情况下完成对目标物的筛查。

2.3GPL大鼠模型的制备及给药

Wistar大鼠适应性饲养1周后随机分为对照组和造模组，对照组8只，造模组22只。对照组大鼠自由饮水，造模组大鼠自由饮用MNNG溶液（μg/mL）。分别于造模第3、4个月末随机取2只造模组大鼠和1只对照组大鼠，取全胃进行苏木精-伊红（HE）染色法染色，观察病理学变化，以评估大鼠模型是否成功。造模第4个月末大鼠全胃出现异型增生病变，将余下18只造模组大鼠随机分为模型组和益胃饮低、高剂量（5、20g/kg）组，每组6只，继续造模4个月，同时对照组和模型组大鼠ig蒸馏水，益胃饮低、高剂量组ig设定剂量的药物，连续4个月。益胃饮高剂量组采用1.09g/mL的益胃饮提取液，益胃饮低剂量组采用稀释4倍后的益胃饮提取液（0.g/mL）。

大鼠麻醉后，腹主动脉取血、全胃，沿胃大弯剪开取1mm3胃小弯体-窦交界处的胃黏膜组织，病灶部位每间隔5mm取材，用10%甲醛溶液固定，脱水后石蜡包埋、切片，厚度为4μm。采用HE和阿利新蓝-过碘酸雪夫氏（AB-PAS）染色法观察大鼠胃黏膜组织的病理变化。根据胃黏膜组织病理结果，筛选出合适样本进行代谢组学分析。

2.4代谢组学分析

2.4.1血清样本制备取大鼠血清μL，加入μL预先于?20℃过夜放置的甲醇-乙睛（1∶1），涡旋30s，4℃r/min离心15min，取上清液于?20℃静置60min，室温放置min，再于4℃r/min离心15min，取上清液4μL进样。

2.4.2色谱条件WatersAcquityUPLCBEHC18色谱柱（mm×2.1mm，1.7μm）；流动相A为0.1%甲酸-乙腈，B为0.1%甲酸溶液，梯度洗脱：0～1min，95%B；1～20min，95～1%B；20～23min，1%B；体积流量为0.4mL/min；柱温为50℃；进样体积为4μL。

2.4.3质谱条件雾化气和干燥气压力为.kPa（55psi），气帘气压力为.kPa（35psi），离子源温度为℃，正离子模式下喷雾电压为＋5V，负离子模式下喷雾电压为?4V；高分辨一级扫描范围为m/z25～0，子离子扫描范围为m/z25～0，一级质谱扫描累积时间为0.15s，二级质谱扫描累积时间为0.s；二级质谱采用IDA模式获得，一级质谱去簇电压为±60V，碰撞能为±10eV；二级质谱去簇电压为±60V，碰撞能为（?35±15）eV。

2.4.4数据分析和统计原始数据经ProteoWizard软件转换成mzXML格式，然后采用off-lineXCMS软件进行峰对齐、保留时间校正、峰面积提取操作。采用MetaboAnalyst4.0进行单变量统计分析，包括变异倍数分析（foldchange，FC）、T检验、火山图分析（volcanoplot，VP）；同时采用SIMCA-P13.0软件进行多元统计分析，数据经Pareto-scaling预处理后，进行模式识别分析，包括主成分分析（principal